Получение инсулина методом генной инженерии

Выдержка из текста

Использование аффинной хромотографии значительно снизило содержание в препарате загрязняющих белков с более высокой молекулярной массой, чем у инсулина. К таким белкам относятся проинсулин и частично расщепленные проинсулины, способные индуцировать выработку антиинсулиновых антител.

Генетическая инженерия (генная инженерия) — совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.

В целом генная инженерия является ветвью биотехнологии, обладающей оригинальным методическим аппаратом: методами цитологии, вирусологии, генетики, Таким образом, учитывая значимость указанной проблематики, была определена цель исследования: изучить генную инженерия как прикладную область науки.

В первой главе данной работы говорится о генной инженерии как науке и создании трансгенных растений, о трансформации растительного генома и способах введения генов в клетки растений. Вторая глава посвящена созданию гербицидоустойчивых растений.

Раньше генетическое разнообразие форм растений и животных — исходного материала для селекции — экспериментально создавалось в селекции методами гибридизации, полиплоидии, мутагенеза и др. При этом принципиальное отличие данных методов от традиционно используемых в селекции, например, мутагенеза, состоит в целенаправленном, а не случайном расширении границ изменчивости генотипа, в планируемом разнообразии исходного материала для селекции.

Генная инженерия это новая, революционная технология, при помощи которой ученые могут извлекать гены из одного организма и внедрять их в любой другой. Генная инженерия — это метод биотехнологии, который занимается исследованиями по перестройке генотипов.

Уже сегодня генная инженерия позволяет включать и выключать отдельные гены, контролируя таким образом деятельность организмов, а также — переносить генетические инструкции из одного организма в другой, в том числе — организмы другого вида.

Но генная инженерия сама по себе не является ни плохой, ни хорошей.

Они и есть основатели генетики. Вторым крупнейшим этапом в истории генетики явилось обоснование Г. Морганом хромосомной теории наследственности, согласно которой основную роль в передаче наследственной информации играют хромосомы клеточного ядра.

Получение инсулина методом генной инженерии

Собственно говоря, в «чистом виде» на практике ни одна из форм движения не наблюдается. Так, механическое перемещение тела, обычно, сопровождается неким изменением его температуры и электрических параметров, все виды физического движения связаны с механическим перемещением молекул, атомов, субатомных частиц и квантов.

Химическое движение также всегда сопровождается процессами механического перемещения частиц и различными видами физического движения. В свою очередь, биологическое движение немыслимо без химического, физического и механического, а социальное движение без биологического.

Кроме того, понятие движения тесно связано с принципом относительности: однозначно сказать, находится ли объект в движении или нет возможно, только сопоставляя его с некоей системой отсчета, связанной с другим объектом или, в ряде случаев, с неким начальным состоянием самого исследуемого объекта.

Глава 4 436

БИОИНДУСТРИЯ
ФЕРМЕНТОВ 436

нон2с—с—с—с—с—сСн
02 Н20 487

—-
НОН2С—с—с—с—с—ct н2о2 I I I I ^он ОН ОНН
он 488

ОСНОВЫ
ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ 489

Ч 566

Получение инсулина методом генной инженерии

ОСНОВЫ
КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ РАСТЕНИЙ 594

Первый
плазмидный вектор был получен С.Коэном
(1973). Его источником была плазмида
Е. coli
R6_5с
Mr
65
кДа. Плазмида стала родоначальником
серии векторов и других структур. Особое
место в генетическом манипулировании
занимает плазмида, от­носящаяся к
группе колициногенных плазмид
Е. coli.

Плазмида
ColEl
(Mr 4,2
МДа) применяется для клонирова­ния
EcoRl-фрагментов.
При этом интеграция чужеродного
фраг­мента в участок узнавания EcoRI
ведет
к фенотипическому изме­нению клетки,
прекращению синтеза колицина с сохранением
иммунности к нему. Этот признак используют
при отборе реком­бинантных трансформантов.

Плазмида
pBR313
содержит
уникальные участки расщеплений нескольких
рестриктаз: EcoRI,
Hindlll, BamHI, Sail, Xmal и
Hpal.
Конструируя
рекомбинантную ДНК, в эти участки можно
встра­

уменьшения
размеров плазмиды вследствие изъятия
участков, не обязательных для репликации
(чем больше плазмида содержит уникальных
участков узнавания для рестриктаз, тем
она универ­сальнее);

Получение инсулина методом генной инженерии

EcoRI
XmnI 4361
Clal
23
ACGI
22462246 Snal 2246 Рис. 5.10. Схема строения плазмиды pBr322Xmalll 939гибридизации
векторов одного рода с другими векторами
или природными плазмидами (например,
получены
гибридные векто­

ры
комбинацией плазмиды и фага
X
(при этом вновь сконструиро­ванная
рекомбинантная ДНК должна сохранить
репликационные свойства исходной
плазмиды);

использования
новых плазмид;

применения
транспозонов;

создания
векторов с генетическими маркерами,
позволяющи­ми вести отбор рекомбинантных
клонов.

Эукариотические
вирусы
до сих пор нашли более скромное
при­менение в качестве векторов.
Практически используются только
онкогенный вирус SV
40
и его производные. Все эти векторы —
дефектные вирусы, не способные давать
полноценные вирусные частицы в клетке
хозяина. Анализируемую ДНК можно вводить
и в другие репликоны, способные
размножаться в клетках, напри­мер
бактериофаги.

Чаще всего из известных
фагов в качестве век­торов применяют
сконструированные производные фага X
и фа­гов М13 и fd.
В
векторах на основе бактериофага X
используется его особенность, состоящая
в том, что большая часть его ДНК не
участвует в размножении фага в клетке.
Это позволяет вводить чужеродную ДНК
в ДНК фага X в качестве вектора.

Фаг
М13 — это одноцепочечная циклическая
ДНК длиной около 6500 нуклеотидов. После
инфицирования бактериальной клетки
одноцепочечная ДНК фага превращается
в двуцепочечную реп- ликативную форму
(RF),
которая
подобна плазмиде. Фаговая ДНК содержит,
кроме того, короткий участок из 500
нуклеотидов, на­званный как МП
(межгенная последовательность), не
существен­ный для ее жизнедеятельности.

Именно в этот участок МП репли- кативной
формы ДНК после расщепления ее с помощью
лигазы вставляют чужеродную ДНК.
Введение рекомбинантной двуцепо- чечной
молекулы в клетку
Е. coliприводит
к ее репликации, син­тезу ( ) цепи,
упаковке последней в белковый чехол и
выделе­нию фага в среду.

IВекторные
плазмиды и векторные вирусы со встроенными
чу-4
жеродными
генами часто называют
гибридными
(или
химернымиi);
плазмидами
(или фагами). После конструирования
рекомбинант-f
ных
ДНК их с помощью трансформации вводят
в реципиентный организм: бактериальную,
грибную, растительную или животнук?
клетку.

Трансформация предусматривает
предварительную o6paf
ботку
клеток соединениями, обусловливающими
проникновени| ДНК внутрь клеток с
последующим их помещением в среду, I
которой способны существовать только
клетки, получившие вещ торную молекулу,
например в среду с определенным антибий
тиком. 1

120

Процесс
инфицирования клеток с помощью чужеродных
ДНК, приводящий к образованию зрелого
фагового потомства, назван трансфекцией.

Практически
общий способ трансформации и трансфекции
основан на том, что при обработке клеток
бактерий СаС12
их мем­брана становится проницаемой
для ДНК. Однако эффективность проникновения
экзогенной ДНК в клетку довольно низка.
Поэто­му среди бактерий, подвергшихся
трансформации, только неболь­шая
часть оказывается трансформированной.

Отделение ее от об­щей массы
осуществляется в процессе клонирования.
Для клони­рования бактериальную
суспензию определенной концентрации
выливают на твердую питательную среду,
например на агар с питательными добавками
в чашке Петри из расчета 5—10 бакте­рий
на 1 см2
поверхности. Бактериальная клетка на
поверхности агара начинает делиться
с образованием в итоге маленькой
коло­нии, похожей на шляпку гриба.
Эта колония называется
клоном, причем
из каждой клетки образуется свой клон,
все клетки кото­рого имеют свойства
бактерии-родоначальника.

Отбор
бактерий-трансформантов можно
продемонстрировать, используя плазмиду
pBR322
(см.
рис. 5.10), содержащую два гена устойчивости
к тетрациклину и ампициллину. Для отбора
этих бак­терий в агар добавляют
антибиотик — или ампициллин, или
тет­рациклин в зависимости от того,
какой из генов (Ыа или tet)
ос­тался
интактным после введения чужеродной
ДНК.

На такой сре­де клоны образуют
клетки только с плазмидами. Для отделения
рекомбинантных бактерий часть материала
каждого клона пере­носят на другую
чашку Петри, содержащую антибиотик,
ген ус­тойчивости к которому был
разрушен при создании рекомбинан- тов.
На этих чашках Петри дают клоны только
те бактерии, кото­рые содержат исходную
плазмиду, а рекомбинантные бактерии
их не образуют.

Рекомбинантные
клоны могут быть идентифицированы и
по синтезируемому ими продукту. Но чаще
приходится идентифици­ровать
непосредственно нуклеотидную вставку
с использованием методов гибридизации.
С этой целью бактериальные колонии
вы­ращивают на нитроцеллюлозных
фильтрах, помещенных на чаш­ку Петри
с питательной средой.

Получение инсулина методом генной инженерии

Затем
фильтр-реплику подвергают щелочной
обработке, при Эт0М
клетки в колониях лизируют и
денатурированная ДНК из клеток
связывается с нитроцеллюлозой в том
участке, где былс. расположена
соответствующая колония. При радиоактивной
ДНК или РНК (меченной 32Р
или 125J)
выдерживание
фильтра в ра створе, содержащем
радиоактивный полинуклеотид, приводит
гибридизации с комплементарными
последовательностями.

5.4.
ЭКСПРЕССИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ

Эффективность
функционирования бактериальных генов
не одинакова, что обусловливает
вариабельность концентрации от­дельных
белков в зависимости от их функций.
Такие вариаций белков, например у
Е. coli,обусловлены
системой контроля ген ной экспрессии,
осуществляемой в основном на уровне
транс крипции ДНК, и зависят от количества
синтезируемой на данно» гене мРНК и
активности фермента РНК-полимеразы.

Порядок чередовании нуклеотидных
последовательностей в промоторно!
участке структурного гена определяет
степень активности РНК- полимеразы и
инициацию процесса транскрипции.
Бактериаль ные гены, включенные в геном,
как правило, экспрессируютс? достаточно
легко, давая мРНК и белок в силу того,
что в сиг нальных последовательностях,
управляющих процессами транс крипции
и трансляции у различных прокариотических
органиЗ мов, много общих черт.

Что
касается экспрессии генов эукариот
бактериях, то она происходит крайне
редко, если не создаваТ специальные
условия, поскольку регуляторные участки
эукариот отличны от таковых у бактерий.
Регуляторные (сигнальные) участк не
узнаются бактериальными РНК-полимеразами,
что привода к замедлению транскрипции.

При клонировании геномной ДНГ{amp}lt;,
эукариотической клетки экспрессия
генов не происходит изч отсутствия у
бактерий системы сплайсинга. Следовательно,
д! экспрессии эукариотических генов в
клетках прокариот необх| димо, чтобы
данные гены находились под контролем
прокари^ тических регуляторных элементов.

В связи с этим для осуществл ния
экспрессии эукариотического гена
соответствующая кДЙ (или синтетическая
ДНК), содержащая кодирующую последов
тельность, в составе векторной молекулы
(например, плазмида присоединяется к
регуляторным элементам бактери и –
промотор оператору и рибосом-связывающему
участку.

Как действует инженерный инсулин человека

При лечении сахарного диабета первого типа применяют инсулин двухфазный человеческий генно инженерный. В аптеках он продается в форме раствора и имеет пометку «Солюбил». Второй тип заболевания также может лечиться таким препаратом, если предписанные медикаменты не подходят для диабетика.

Также инсулин генно инженерный используется, если у человека диабетическая кома. Нередко врачи назначают уколы беременным женщинам с диагнозом сахарный диабет, когда не помогают сахароснижающие таблетки и лечебная диета.

Получение инсулина методом генной инженерии

В целом генно инженерные инсулины или ГМО используются во время родов, когда проводят хирургическую операцию, или если диабетик получил тяжелую физическую травму. Лекарственное средство позволяет безопасным путем перейти к использованию быстро действующих гормонов.

  1. Перед тем, как применять инсулин двухфазный человеческий генно инженерный, необходимо обязательно сделать пробу и выяснить, подходит ли данное лекарство пациенту. При выявлении у диабетика гипогликемии использовать препарат не рекомендуется.
  2. Схема действия раствора заключается в том, что генноинженерный инсулин вступает во взаимодействие с клетками, что приводит к образованию комплексов. При попадании клеток в эти комплексы они стимулируются и начинают активнее работать. В результате вырабатывается большее количество ферментов.
  3. В процессе глюкоза быстрее усваивается, попадающие в организм углеводы подвергаются активной переработке. Таким образом, печень дольше вырабатывает глюкозу, а белки могут усвоиться намного быстрее.

Литература

1. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Сахарный диабет: современные аспекты диагностики и лечения/ Доктор; под ред. Г. Л. Вышковского.-2005.- М.: РЛС-2005, 2004.- 960 с.

2. Гавриков, А.В. Оптимизация биотехнологического производства субстанций рекомбинантных интерферонов человека: дис. … канд. биол. наук — М, 2003 г.

3. Генно-инженерный инсулин человека. Повышение эффективности хроматографического разделения при использовании принципа бифункциональности. / Романчиков А.Б., Якимов С.А., Клюшниченко В.Е., Арутунян А.М., Вульфсон А.Н. // Биоограническая Химия, 1997 — 23, № 2

4. Глик Б., Пастернак Дж. Контроль применения биотехнологических методов// Б. Глик, Дж. Пастернак / Молекулярная биотехнология = Molecular Biotechnology. — М.: Мир, 2002. — С. 517−532. — 589 с.

5. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 2002.

6. Девис Р., Ботстайн Д, Рот Дж. Методы генетической инженерии. Генетика бактерий // Р. Девис, Д. Ботстайн, Дж. Рот / Пер. с англ.-М.: Мир.- 1984.- 176 с.

7. Ермишин А.П. Генетически модифицированные организмы: мифы и реальность / А.П.Ермишин// Мн.: Тэхналогйя.- 2004. — 118 с.

Получение инсулина методом генной инженерии

8. Основы фармацевтической биотехнологии: Учебное пособие / Т.П. Прищеп, В.С. Чучалин, К.Л. Зайков, Л.К. Михалева. — Ростов-на-Дону.: Феникс; Томск: Издательство НТЛ, 2006.

9. Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. // Л. И. Патрушев/ М.: Наука.- 2004.

10. Романчиков, А.Б. Генно-инженерный инсулин человека. Повышение эффективности хроматографического разделения при использовании принципа бифункциональности. / А.Б. Романчиков [и др.]

11. Рыбчин В. Н. Основы генетической инженерии// В. Н. Рыбчин / 2-е изд, перераб. и доп.: Учебник для вузов. СПб.: Изд-во СПбГТУ. — 2002. — 522 с.

12. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия // Щелкунов С. Н. /Новосибирск: Сиб. унив. изд-во.-2008.

Получение инсулина методом генной инженерии

13. Щелкунов, С.Н. Генетическая инженерия: учеб-справ. пособие. — 2-е, изд., испр. и доп. — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. — 496 с.

Рекомендации по использованию препарата

https://www.youtube.com/watch?v=GvIX1Kwtd5Q

Солюбил или инсулин двухфазный человеческий генно инженерный обладает разными торговыми названиями. Также гормоны могут различаться по длительности действия, способу приготовления раствора. Продукты получают название, основываясь на виде инсулина.

Генно инженерные инсулины входят в состав таких лекарственных средств, как Хумудар, Возулим, Актрапид. Инсуран, Генсулин. Это далеко не полный список подобных препаратов, их количество достаточно большое.

К двухфазным комбинированным препаратам относят лекарства, в состав которых входят определенные компоненты, которые меняют период воздействия лекарственного средства.

  • Такие препараты продаются в виде смесей, в их состав в том числе входят гормоны, полученные генетически.
  • К подобным средствам относят Микстард, Инсуман, Гансулин, Генсулин.
  • Препараты применяются дважды в сутки, за полчаса до приема пищи. Такой системы следует строго придерживаться, так как гормон напрямую связан с периодом потребления еды.

Путем генного получения инсулина человека получают препарат, который имеет средний срок воздействия.

  1. Раствор вступает в действие на протяжении 60 минут, но момент наивысшей активности наблюдается через шесть-семь часов после укола.
  2. Лекарство полностью выводится из организма через 12 часов.
  3. К таким лекарственным средствам относят Инсуран, Инсуман, Протафан, Ринсулин, Биосулин.

Также существуют ГМО, имеющие короткий период воздействия на организм. К ним относятся лекарственные средства инсулин Актрапид, Гансулин, Хумулин, Инсуран, Ринсулин, Биоинсулин. Такие инсулины имеют активную фазу через два-три часа, а первые признаки действия лекарства можно заметить уже через полчаса после инъекции.

Получение инсулина методом генной инженерии

Используемый инсулин должен иметь комнатную температуру. Дозировка гормона должна обязательно корректироваться, если у диабетика инфекционное заболевание, нарушение работы щитовидной железы, болезнь Аддисона, гипопитуитаризм, хроническая болезнь почек.

Приступы гипогликемии возможны при передозировке препарата, в случае перехода на новый тип инсулина, из-за пропуска приема пищи или физического перенапряжения. Также виной могут быть болезни, которые снижают потребность в гормоне — тяжелая степень почечной болезни, заболевание печени, пониженная работа щитовидной железы, коры надпочечников, гипофиза.

  1. Резкое понижение уровня сахара в крови возможно при смене области инъекции. Поэтому переходить с одного типа инсулина нужно обоснованно и только после согласования с лечащим врачом.
  2. Если диабетик использует инсулин короткого действия, иногда в месте укола уменьшается или, наоборот, увеличивается объем жировых тканей. Чтобы этого не допустить, инъекцию нужно делать в разных местах.

Беременным женщинам нужно обязательно учитывать, что в разные триместры беременности потребность в инсулине может меняться. Для этого нужно каждый день проводить исследование уровня сахара в крови при помощи глюкометра.

О действии инсулина на организм человека подробно рассказано в видео в этой статье.

Симптомы передозировки

В случае несоблюдения правил и передозировки у диабетика начинаются сильные головные боли, судороги, чувство голода, повышается потливость, учащается сердцебиение, человек переутомляется, становится раздражительным. Также может наблюдаться озноб во всем теле и дрожь.

Такие симптомы очень похожи на признаки снижения показателей глюкозы в крови. При легкой стадии симптоматики диабетик может самостоятельно решить проблему и улучшить состояние. Для этого нужно съесть конфетку или любой другой сладкий продукт, в котором содержится сахар.

  • Если наступила диабетическая кома, пользуются раствором декстрозы, препарат вводятся внутривенным путем до тех пор, пока человек не окажется в сознании. При первых подозрительных признаках необходимо вызвать скорую помощь, которая сможет экстренными методами привести в себя больного.
  • В качестве побочных эффектов после применения ГМО у человека появляются высыпания на кожных покровах в виде крапивницы, отекают части тела, резко понижается уровень артериального давления, может наблюдаться зуд и одышка. Это аллергическая реакция на лекарственное средство, которая через некоторое время может самостоятельно исчезнуть без врачебного вмешательства. Если ситуация продолжается, нужно проконсультироваться с лечащим врачом.
  • В первые дни приема препарата инсулина у диабетиков нередко обезвоживается организм, человек испытывает нехватку жидкости, ухудшается аппетит, появляются отеки на руках и ногах, ощущается постоянная сонливость. Такие симптомы обычно быстро проходят и не повторяются.
Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Медицинский словарик
Adblock detector